Идентификация малых молекул, способных усиливать слияние вирусных мембран

Журнал вирусологии, том 20, Номер статьи: 99 (2023) Цитировать эту статью

350 доступов

2 Альтметрика

Подробности о метриках

Для анализа проникновения высокопатогенных вирусов было разработано несколько подходов. В этом исследовании мы сообщаем о внедрении анализа бимолекулярной многоклеточной комплементации (BiMuC) для безопасного и эффективного мониторинга S-опосредованного слияния мембран SARS-CoV-2 без необходимости использования оборудования на основе микроскопии. Используя BiMuC, мы проверили библиотеку одобренных лекарств и идентифицировали соединения, которые усиливают опосредованное S-белком слияние клеточных мембран. Среди них этинилэстрадиол способствует росту SARS-CoV-2 и вируса гриппа А in vitro. Наши результаты демонстрируют потенциал BiMuC для идентификации небольших молекул, которые модулируют жизненный цикл вирусов с оболочкой, включая SARS-CoV-2.

Новый тяжелый острый респираторный синдром коронавирус-2 (SARS-CoV-2) [1, 2] стал причиной пандемического заболевания, известного как коронавирусная болезнь 2019 года (COVID-19). Это заболевание оказало и продолжает оказывать огромное влияние на наши системы здравоохранения и мировую экономику. Соответственно, были предприняты чрезвычайные усилия по разработке профилактических и терапевтических мер для снижения заболеваемости и смертности, связанных с заболеванием COVID-19.

Клеточная мембрана является первым барьером, с которым сталкивается вирус при заражении новой клетки. В какой-то момент проникновения оболочечные вирусы должны слиться с клеточной и вирусной мембранами. В случае SARS-CoV-2 за проникновение в клетки-хозяева отвечает высокогликозилированный белок-шип (S) [3]. Белок S, тримерный слитый белок класса I [4], транслируется в неактивной форме (S0). Протеолитическая активация S0 протеазами хозяина (т.е. TMPRSS2) приводит к образованию зрелого белка S перед слиянием, включенного в вирионы [5]. Инфекционный процесс начинается со связывания белка S с ангиотензинпревращающим ферментом 2 (ACE2) на поверхности клетки [2, 6]. Связывание с ACE2 вызывает конформационные изменения, приводящие к воздействию пептида слияния S-белка, который будет взаимодействовать с мембраной хозяина и инициировать слияние вирусной и клеточной мембран. Содействие любому из многочисленных этапов этого сложного процесса ускорит и увеличит производство вирусов, ускорит разработку традиционных вакцин, снизит производственные затраты и увеличит выход продукции [7].

Для безопасного анализа проникновения вируса было разработано множество подходов, включая анализы на основе псевдотипированных вирусов, анализы на основе вирусоподобных частиц, биохимические анализы или анализы слияния клеток. Идентификация синцития из-за экспрессии механизма слияния вируса и соответствующего рецептора хозяина на клеточной поверхности традиционно проводилась с помощью микроскопии. Однако методологии на основе микроскопа препятствуют количественной оценке процесса синтеза и реализации высокопроизводительных методов идентификации малых молекул.

Для изучения S-опосредованного процесса слияния мембран SARS-CoV-2 мы решили адаптировать недавно разработанный анализ бимолекулярной многоклеточной комплементации (BiMuC) [8]. Основываясь на свойствах бимолекулярной комплементации флуоресцентного репортерного белка, этот анализ облегчает идентификацию и количественную оценку событий вирус-индуцированного слияния клеток без помощи микроскопического оборудования. После размещения BiMuC для изучения SARS-CoV-2 мы установили экран для малых молекул, способных модулировать процесс слияния мембран, опосредованный S-белком. Используя этот анализ, мы проверили 1280 малых молекул и установили, что этинилэстрадиол усиливает опосредованное S-белком слияние межклеточных мембран. В результате этинилэстрадиол усиливает рост SARS-CoV-2 in vitro. Более того, влияние на вирусно-опосредованное слияние мембран не ограничивается SARS-CoV-2. Мы продемонстрировали, что этинилэстрадиол может увеличивать рост вируса гриппа А и слияние мембран вируса Нипах. Наши результаты показывают, что BiMuC можно использовать для мониторинга процесса слияния мембран SARS-CoV-2 и идентификации небольших молекул, которые нарушают этот процесс.

1.5. Hits were confirmed in secondary screening. This time cells included the pRL-Renilla. The luminescence was measured using the Renilla Luciferase Assay kit from Sigma following the manufacturer protocol on 96-well white cell-culture plates. This measure facilitates the elimination of those compounds promoting cell division or survival, thus increasing the fluorescence signal without effectively increasing cell-cell fusion. To discard the hits that had fluorescent properties similar to VFP, cells were seeded in black 96-well plates and treated with the compounds under the same conditions as described above. In this case, fluorescence was measured as before (λexc = 485 nm, λem = 535 nm). In all assays, [DMSO] was kept at ≤ 1%. Statistical analysis was done with Libre Office Calc./p> 1.5 (Table S1). Hits were re-tested using the same experimental conditions and selection criteria. Only the compounds capable of enhancing viral fusion in both rounds were considered (Fig. 2B). Additionally, we measured the luminescence from the Renilla luciferase and eliminated those compounds promoting cell division or survival, thus increasing the fluorescence signal without effectively increasing cell-cell fusion. We also tested the fluorescence properties of the remaining hits and discarded those compounds emitting near 530 nm (Fig. 2B)./p>