Рациональный дизайн ультрастабильных и обратимо фотопереключаемых флуоресцентных белков для супер

Научные отчеты, том 6, Номер статьи: 18459 (2016) Цитировать эту статью

5920 Доступов

42 цитаты

1 Альтметрика

Подробности о метриках

Фототрансформируемые флуоресцентные белки занимают центральное место в нескольких подходах к наноскопии. Однако пока не существует доступного варианта, позволяющего получать изображения со сверхвысоким разрешением в клеточных компартментах, которые поддерживают окислительные условия. Здесь мы сообщаем о рациональном дизайне двух обратимо переключаемых флуоресцентных белков, способных сворачиваться и фотопереключаться в бактериальной периплазме, rsFolder и rsFolder2. rsFolder был разработан путем гибридизации Superfolder-GFP с rsEGFP2 и унаследовал свойства быстрого сворачивания первого вместе с быстрым переключением второго, но за счет снижения контраста переключения. Структурная характеристика механизмов переключения rsFolder и rsEGFP2 выявила различные сценарии цис-транс-изомеризации хромофора и позволила создать rsFolder2, вариант rsFolder, который демонстрирует улучшенный контраст переключения и поддается наноскопии RESOLFT. rsFolders могут эффективно экспрессироваться в периплазме E. coli, открывая двери для наномасштабного исследования белков, локализованных в до сих пор ненаблюдаемых клеточных компартментах.

Наномасштабная визуализация внутриклеточных деталей живых клеток с помощью микроскопии сверхвысокого разрешения часто основана на использовании «фототрансформируемых» флуоресцентных белков (PTFP) в качестве генетически кодируемых маркеров1. Соответственно, разработка PTFP с улучшенными биохимическими или фотофизическими свойствами способствовала развитию большого разнообразия подходов к наноскопии2,3. Примечательно, что такие методы, как RESOLFT (обратимые насыщающиеся оптические флуоресцентные переходы)4, нелинейная SIM (микроскопия структурированного освещения)5 или pcSOFI (фотохромная стохастическая оптическая флуоресцентная визуализация)6, используют обратимо переключаемые флуоресцентные белки (RSFP), которые способны многократно переключаться между флуоресцентными («включено») и нефлуоресцентное («выключено»). В так называемых зеленых RSFP с «отрицательным переключением» переход «включено-выключено» конкурирует с излучением флуоресценции при освещении голубым светом (~ 490 нм), тогда как переход «выключено-включено» быстро реагирует на освещение фиолетовым светом (~ 405 нм). Подсемейство отрицательных RSFP сначала состояло из Dronpa7 и его вариантов8,9 и постепенно обогащалось другими белками антозойного происхождения (кораллы и анемоны), такими как rsCherryRev10, rsTagRFP11, mGeos's12 и бифотохромными IrisFP13 и NijiFP14. Однако развитие наноскопии RESOLFT в живых клетках требует RSFP, которые эффективно переключаются даже при низкой мощности освещения (чтобы минимизировать фотоповреждения), демонстрируют минимальную остаточную флуоресценцию в выключенном состоянии (для максимизации контраста) и обладают высокой устойчивостью к усталости переключения (чтобы минимизировать фотоповреждения). выдержать большое количество последовательных циклов включения-выключения). Было обнаружено, что варианты, полученные из флуоресцентных белков гидрозойного происхождения (медузы) и, в частности, из хорошо известного EGFP, могут удовлетворять этим требованиям, приводя к образованию rsEGFP15 и rsEGFP216. Совсем недавно сообщалось о вариантах rsEGFP, полученных путем направленной эволюции, которые созревают и более эффективно экспрессируются в цитозоле клеток млекопитающих17. Также были представлены RSFP антозойного происхождения с улучшенными свойствами фотопереключения, включая положительный переключатель Kohinoor18, произошедший от Padron8, и отрицательный переключатель Skylan-S, произошедший от mEos3.119.

Несмотря на интенсивное развитие PTFP, некоторые клеточные субструктуры остаются плохо изученными на наноуровне, в частности, те отделы, где происходит окислительное сворачивание, такие как пероксисома, эндоплазматический ретикулум, митохондриальное межмембранное пространство или бактериальная периплазма. Эти компартменты содержат большое количество ключевых макромолекул, участвующих, например, в поглощении лекарств, производстве энергии или окислительном метаболизме. Основная причина этого пробела в области сверхразрешения заключается в том, что флуоресцентные белки, как правило, неспособны правильно сворачиваться и излучать свет в сильно окислительных средах20. Таким образом, необходима разработка PTFP, способного к окислительному сворачиванию, чтобы облегчить визуализацию таких компартментов в живых клетках со сверхвысоким разрешением.