Прямой генетический скрининг с использованием точечной шкалы глазного дна выявил важную роль Липе в гомеостазе сетчатки мыши.

Биология связи, том 6, Номер статьи: 533 (2023) Цитировать эту статью

310 Доступов

3 Альтметрика

Подробности о метриках

Микроглия играет роль в патогенезе многих заболеваний сетчатки. Пятна на глазном дне у мышей часто коррелируют с накоплением активированной субретинальной микроглии. Здесь мы используем полуколичественную шкалу оценки пятен на глазном дне в сочетании с беспристрастным, современным передовым генетическим конвейером для выявления причинных связей между химически индуцированными мутациями и фенотипами пятен на глазном дне. Среди нескольких ассоциаций мы уделяем особое внимание миссенс-мутации у Липе, связанной с увеличением желтых пятен на глазном дне у мышей C57BL/6J. Обнаружено, что у мышей Lipe-/-, созданных с использованием технологии CRISPR-Cas9, развивается накопление субретинальной микроглии, дегенерация сетчатки со снижением зрительной функции и аномальный липидный профиль сетчатки. Мы установили незаменимую роль Липе в липидном гомеостазе сетчатки/РПЭ и здоровье сетчатки. Дальнейшие исследования с использованием этой новой модели будут направлены на определение того, как нарушение регуляции липидов приводит к активации субретинальной микроглии и играют ли эти микроглии роль в последующей дегенерации сетчатки.

Большое количество исследований показало связь между активированной микроглией сетчатки и такими заболеваниями, как возрастная дегенерация желтого пятна (ВМД), дистрофии сетчатки и диабетическая ретинопатия1,2,3,4,5,6,7,8,9. До сих пор ведутся споры о том, являются ли эти клетки вредными (способствуя воспалению)9,10,11,12,13,14,15 или гомеостатическими (путем удаления остатков)16. На самом деле возможно, что при разных обстоятельствах они могут быть либо 7,10,17,18,19,20. Мы предполагаем, что идентификация генов, которые модулируют накопление субретинальной микроглии, поможет нам определить пути, необходимые для гомеостаза сетчатки. Более того, тщательная характеристика полученных моделей на мышах может также пролить свет на механизмы, регулирующие иммунный надзор, транспорт клеток и нейровоспаление в сетчатке. Имея в виду эти цели, мы применяем точечный скрининг глазного дна к нашему современному научному конвейеру прямой генетики21,22, чье самое большое преимущество по сравнению с другими протоколами прямой генетики23,24,25,26,27,28,29 , является тот факт, что все проверенные мыши представляют собой мыши G3, которые были предварительно генотипированы по всем мутантным локусам, что позволяет быстро определить причинные мутации22. Это дает нам возможность исследовать ассоциации генов и фенотипов, которые другие могут игнорировать. При традиционном прямом генетическом скрининге требуется огромное количество усилий для выявления любых потенциальных «попаданий», поскольку многие из них используют ауткросс/интеркросс с картируемым штаммом в сочетании с секвенированием экзома для ретроспективного выявления причинных мутаций, а это процесс, требующий времени. потребляющий. Это отбивает охоту к поиску любых ассоциаций, не приводящих к тяжелой патологии.

Хотя точный состав белых/желтых субретинальных пятен, видимых на фотографиях глазного дна мышей в различных моделях, не совсем определен, мы и другие ранее показали, что они хорошо коррелируют с Iba1+ субретинальной микроглией10,30,31,32. Мы разработали шкалу33 для проведения быстрого и воспроизводимого полуколичественного анализа этих пятен. Здесь мы использовали эту шкалу пятен на глазном дне для скрининга около 6000 мышей G3 на наличие мутаций, которые изменили оценки пятен на глазном дне по сравнению с мышами дикого типа. Мы идентифицировали несколько генов, мутация которых приводила к накоплению пятен на глазном дне. Уже известно, что шесть из этих генов вызывают патологию сетчатки (дополнительная таблица S1), что является доказательством принципа. Исходя из ассоциаций ген-фенотип, мы решили исследовать ген Липе, как потому, что его мутация привела к сильному фенотипу накопления пятен на глазном дне, так и потому, что шкала пятен на глазном дне была единственным параметром скрининга, который позволил нам его идентифицировать.

В этой работе мы также демонстрируем, что линия мышей Lipe-/-, созданная с помощью CRISPR, воспроизводит наши выводы об обширном скоплении пятен на глазном дне на фотографиях сетчатки. Мы показываем, что у них развивается накопление субретинальной микроглии и дегенерация сетчатки. Затем мы характеризуем этих мышей, уделяя особое внимание визуализации сетчатки, анатомии и ультраструктуре сетчатки, гибридизации in situ, электрофизиологии и иммуногистохимии. Наконец, используя сверхвысокоэффективную жидкостную хроматографию с масс-спектрометрией, мы демонстрируем, что у мышей Lipe-/- наблюдаются аномалии липидного обмена в сетчатке и РПЭ.