3D морфогенез in vitro кишечного эпителия человека в кишечнике

Nature Protocols, том 17, страницы 910–939 (2022 г.) Цитировать эту статью

13 тысяч доступов

35 цитат

8 Альтметрика

Подробности о метриках

Морфогенез кишечника человека устанавливает трехмерную эпителиальную микроархитектуру и пространственно организованные характеристики крипт-ворсинок. Эта уникальная структура необходима для поддержания гомеостаза кишечника путем защиты ниши стволовых клеток в базальных криптах от экзогенных микробных антигенов и их метаболитов. Кроме того, кишечные ворсинки и секреторная слизь представляют собой функционально дифференцированные эпителиальные клетки с защитным барьером на поверхности слизистой оболочки кишечника. Таким образом, воссоздание трехмерной эпителиальной структуры имеет решающее значение для построения моделей кишечника in vitro. Примечательно, что органомиметическая «кишка на чипе» может индуцировать спонтанный 3D-морфогенез кишечного эпителия с улучшенными физиологическими функциями и биомеханикой. Здесь мы предоставляем воспроизводимый протокол для надежной индукции морфогенеза кишечника в микрожидкостном кишечнике на чипе, а также в гибридном чипе, встроенном в Transwell. Мы описываем подробные методы изготовления устройств, культуры Caco-2 или эпителиальных клеток кишечных органоидов в обычных установках, а также на микрофлюидных платформах, индукции 3D-морфогенеза и характеристики установленного 3D-эпителия с использованием нескольких методов визуализации. Этот протокол позволяет восстановить функциональную микроархитектуру кишечника путем контроля базолатерального потока жидкости в течение 5 дней. Наш метод морфогенеза in vitro использует физиологически значимое напряжение сдвига и механические движения и не требует сложной клеточной инженерии или манипуляций, что может быть преимуществом по сравнению с другими существующими методами. Мы предполагаем, что предлагаемый нами протокол может оказать широкое влияние на биомедицинские исследовательские сообщества, предоставляя метод регенерации трехмерных эпителиальных слоев кишечника in vitro для биомедицинских, клинических и фармацевтических применений.

Экспериментально было продемонстрировано, что эпителиальные клетки Caco-2 кишечника, культивируемые в режиме «кишка на чипе»1,2,3,4,5 или в двухслойном микрофлюидном устройстве6,7, могут подвергаться спонтанному 3D-морфогенезу in vitro без четкого понимания лежащий в основе механизм. В нашем недавнем исследовании мы определили, что удаление антагонистов морфогена, которые базолатерально секретируются из культуральной установки, необходимо и достаточно для индукции 3D-эпителиального морфогенеза in vitro, что подтверждено как с Caco-2, так и с органоидным эпителием кишечника, полученным от пациента4. В этом исследовании мы специально сосредоточились на клеточном производстве и профиле концентрации мощного антагониста Wnt, Dickkopf-1 (DKK-1), как в кишечнике на чипе, так и в модифицированном микрофлюидном устройстве, содержащем вставку Transwell, называемую «гибридный чип». Мы подтвердили, что экзогенное добавление антагонистов Wnt (например, DKK-1, фактора, ингибирующего Wnt 1, секретируемого белка 1, родственного завиткам, или Soggy-1) в кишечник на чипе приводит к ингибированию морфогенеза или нарушению предварительно структурированные трехмерные эпителиальные слои, что позволяет предположить, что антагонистическое давление во время культивирования отвечает за морфогенез кишечника in vitro. Таким образом, практические подходы к обеспечению устойчивого морфогенеза на поверхности эпителия заключаются в том, чтобы либо удалить, либо минимально поддерживать уровень антагонистов Wnt в базолатеральном компартменте путем активного вымывания (например, на платформах «кишка на чипе» или гибридных чипов) или диффузии. базолатеральный культуральный бульон (например, из вставки Transwell в большой базолатеральный резервуар в лунке).

В этом протоколе мы предоставляем подробные методы изготовления микроустройства «кишка на чипе» и вставляемого в Transwell гибридного чипа (шаги 1–5), культивирования эпителиальных клеток кишечника на пористой мембране на основе полидиметилсилоксана (ПДМС) (шаги 6А, 7А, 8, 9) или полиэфирную мембрану вставки Transwell (этапы 6B, 7B, 8, 9) и индуцирование 3D-морфогенеза in vitro (этап 10). Мы также идентифицируем клеточные и молекулярные характеристики, которые указывают на тканеспецифический гистогенез и зависимую от линии цитодифференцировку, применяя несколько методов визуализации (шаги 11–24). Мы индуцируем морфогенез, используя эпителиальные клетки кишечника человека, такие как Caco-2, или кишечные органоиды, в обоих форматах культуры с техническими деталями, включая модификацию поверхности пористой мембраны, создание 2D-монослоя и повторение биохимической и биомеханической микросреды кишечника в пробирка. Чтобы вызвать 3D-морфогенез из 2D-эпителиального монослоя, мы удаляем антагонисты морфогена в обоих форматах культур, пропуская культуральную среду в базолатеральный отсек культур. Наконец, мы приводим репрезентативные примеры полезности регенеративных трехмерных эпителиальных слоев, которые потенциально могут быть использованы для моделирования морфоген-зависимого роста эпителия, продольных совместных культур хозяина и микробиома, патогенной инфекции, воспалительного повреждения, дисфункции эпителиального барьера и терапевтических средств на основе пробиотиков. эффект.